Paano Gumagana ang Reaksiyon ng Polymerase Chain upang Dagdagan ang mga Gene

Ang polymerase chain reaction (PCR) ay isang molecular genetic technique para sa paggawa ng maramihang mga kopya ng isang gene at bahagi din ng proseso ng pagkakasunud-sunod ng gene.

Paano Gumagana ang Reaksyon ng Polymerase Chain

Ginagawa ang mga kopya ng gene gamit ang isang sample ng DNA, at ang teknolohiya ay sapat na upang gumawa ng maraming kopya mula sa isang solong kopya ng gene na matatagpuan sa sample. Ang PCR paglala ng isang gene upang gumawa ng milyun-milyong kopya, ay nagbibigay-daan para sa pagtuklas at pagkakakilanlan ng mga pagkakasunud-sunod ng gene gamit ang mga visual na diskarte batay sa laki at singil (+ o -) ng piraso ng DNA.

Sa ilalim ng mga kondisyon na kinokontrol, ang mga maliit na segment ng DNA ay binuo ng mga enzyme na kilala bilang DNA polymerases, na nagdadagdag ng komplimentaryong deoxynucleotides (dNTPs) sa isang piraso ng DNA na kilala bilang "template." Kahit na mas maliit na piraso ng DNA, tinatawag na "primers" ang ginagamit bilang panimulang punto para sa polymerase.

Ang mga panimulang aklat ay maliit na ginawa ng mga piraso ng DNA (oligomer), kadalasan sa pagitan ng 15 at 30 nucleotide ang haba. Ang mga ito ay ginawa sa pamamagitan ng pag-alam o paghula sa maikling mga pagkakasunud-sunod ng DNA sa mga dulo ng gene na pinalaki. Sa panahon ng PCR, ang sequenced DNA ay pinainit at ang hiwalay na mga hiwalay na hiwalay. Sa paglamig, ang mga primer ay magbigkis sa template (tinatawag na annealing) at lumikha ng isang lugar para sa polymerase upang magsimula.

Ang PCR Technique

Ang polimerase kadena reaksyon (PCR) ay ginawa posible sa pamamagitan ng pagtuklas ng thermophiles at thermophilic polymerase enzymes (enzymes na nagpapanatili ng estruktural integridad at pag-andar matapos ang pag-init sa mataas na temperatura). Ang mga hakbang na kasangkot sa pamamaraan ng PCR ay ang mga sumusunod:

• Ang halo ay nilikha, na may na-optimize na mga konsentrasyon ng template ng DNA, polimerase enzyme, primer, at dNTP. Ang kakayahang magpainit ng pinaghalong walang pagtanggi sa enzyme ay nagbibigay-daan para sa pagtanggi ng double helix ng DNA sample sa mga temperatura sa hanay na 94 degrees Celsius.
• Pagkatapos ng denaturasyon, ang sample ay cooled sa isang mas katamtaman hanay, sa paligid ng 54 degrees, na kung saan facilitates ang pagsusubo (umiiral) ng primers sa single-stranded DNA templates.
• Sa ikatlong hakbang ng cycle, ang sample ay reheated sa 72 degrees, ang perpektong temperatura para sa Taq DNA Polymerase, para sa pagpahaba. Sa panahon ng pagpahaba, ang DNA polymerase ay gumagamit ng orihinal na solong strand ng DNA bilang isang template upang magdagdag ng mga komplementaryong dNTP sa 3 'dulo ng bawat primer at bumuo ng isang seksyon ng double-stranded DNA sa rehiyon ng gene ng interes.

• Ang mga primer na may annealed sa DNA sequence na hindi isang eksaktong tugma ay hindi mananatiling annealed sa 72 degrees, kaya nililimitahan ang pagpahaba sa gene ng interes.

Ang prosesong ito ng denaturing, annealing at pagpahaba ay paulit-ulit na maramihang (30-40) na beses, sa gayon ang pagtaas ng exponentially ang bilang ng mga kopya ng nais na gene sa pinaghalong. Kahit na ang proseso na ito ay lubos na nakakapagod kung gumanap nang manu-mano, ang mga sample ay maaaring ihanda at inkubated sa isang Programmable Thermocycler, ngayon pangkaraniwan sa karamihan sa molekular laboratoryo, at isang kumpletong reaksyon ng PCR ay maaaring maisagawa sa 3-4 na oras.

Ang pagtanggi ng bawat hakbang ay humahadlang sa proseso ng pagpahaba ng nakaraang ikot, kaya pinuputol ang bagong strand ng DNA at pinapanatili ito sa humigit-kumulang sa sukat ng ninanais na gene. Ang tagal ng siklo ng pagpahaba ay maaaring mas mahaba o mas maikli depende sa sukat ng gene ng interes, ngunit sa kalaunan, sa pamamagitan ng paulit-ulit na mga pag-ikot ng PCR, ang karamihan sa mga template ay limitado sa laki ng gene ng interes lamang, habang sila Ay nabuo mula sa mga produkto ng parehong mga primers.

Mayroong maraming iba't ibang mga kadahilanan para sa matagumpay na PCR na maaaring manipulahin upang mapahusay ang mga resulta. Ang pinaka-tinatanggap na paraan upang subukan ang pagkakaroon ng produkto ng PCR ay ang agarose gel electrophoresis. Na ginagamit upang paghiwalayin ang mga fragment ng DNA batay sa laki at singil. Pagkatapos ay makita ang mga fragment gamit ang tina o radioisotopes.

Ang ebolusyon

Dahil ang pagkatuklas ng PCR, ang mga polymerase ng DNA maliban sa orihinal na Taq ay natuklasan. Ang ilan sa mga ito ay may mas mahusay na "proofreading" kakayahan o mas matatag sa mga mas mataas na temperatura, kaya ang pagpapabuti ng pagtitiyak ng PCR at pagbawas ng mga error mula sa pagpapasok ng maling dNTP.

Ang ilang mga pagkakaiba-iba ng PCR ay dinisenyo para sa mga partikular na application at regular na ginagamit na ngayon sa molecular genetic laboratories. Ang ilan sa mga ito ay Real-Time PCR at Reverse-Transcriptase PCR. Ang pagkatuklas ng PCR ay humantong din sa pagpapaunlad ng DNA sequencing, fingerprinting DNA at iba pang mga pamamaraan ng molekular.