Ano ang Kinakailangan para sa Mga Resulta ng Superior PCR

01 Malinis na Mga Kundisyon ng Laboratoryo

Dahil ang PCR ay may kakayahang maghanap ng isang molekula ng DNA, mahalaga na mapanatili ang mga malinis na kondisyon sa laboratoryo. Laging magsuot ng sariwang guwantes; gumamit ng sterile glassware, tubes, at mga tip ng pipette; at linisin ang lugar ng trabaho bago magsimula ang trabaho.

Palaging isama ang mga reaksyon ng kontrol, walang template DNA at walang enzyme, upang matiyak na ang mga resulta ay tunay na dahil sa paglaki ng tamang sample.

Tinitiyak ng karamihan ng mga tao na magkaroon ng kanilang sariling mga hanay ng mga solusyon na hindi ibinabahagi upang gawing mas madali ang pag-troubleshoot at ang mga pipet na itinalaga ay karaniwang itinatabi para sa PCR lamang. Ang mga DNase at RNase-free na mga tubo ng PCR, mga tip sa pugon ng aerosol, at nagtatrabaho sa isang fume hood na may UV light ay mga paraan upang mabawasan ang mga problema.

02 Mga Bahagi ng Kemikal

Gayundin ng mga kritikal na kahalagahan ay ang kadalisayan at integridad ng template (purified DNA) at panimulang disenyo. Mayroong ilang mga programa ng software na magagamit online para sa pagdisenyo ng mga primer. Ang pinakamahusay na primers:

• Magkaroon ng 18 hanggang 24 na mga base
• Wala pang sekundaryong istraktura (hal., Mga balbas ng buhok)
• May balanseng pamamahagi ng mga pares ng G / C at A / T
• Ay hindi komplimentaryong sa bawat isa sa 3-paa dulo
• Magkaroon ng temperatura ng pagtunaw (Tm) tungkol sa 5-10 degrees Celsius sa ibaba ng temperatura ng pagsusubo, na karaniwan ay sa pagitan ng 55 at 65 degrees Celsius. Ang Tm para sa parehong mga primer ay dapat ding magkatulad para sa mga pinakamahusay na resulta.

03 Reaction Mix: Template at Primers

Ang proporsyon ng pinaghalong reaksyon ay may malaking impluwensya sa kalidad ng mga resulta ng PCR. May pangkalahatang pormula para sa mga konsentrasyon ng template, enzyme, primer, at nucleotide na gagamitin, ngunit ito ay maaaring tweaked nang kaunti.

Ang pinakamainam na mga concentrasyon ng panimulang aklat ay sa pagitan ng 0.1 at 0.6 micromoles / L. Ang halaga ng template ay nag-iiba depende sa uri ng DNA (tao, bacterial, plasmid).

Sa napakababang halaga ng template, may iba pang mga estratehiya upang mapabuti ang mga resulta, tulad ng nadagdagan na mga numero ng pag-ikot o paggamit ng "mainit na pagsisimula." Laging subukan ang mga bagong primer na may positibong kontrol reaksyon, upang matiyak na gumagana ang mga ito sa ilalim ng iyong partikular na mga kondisyon sa experimental.

04 Reaction Mix: Enzyme Activity

Ang pagpili ng DNA polymerase ay nakakaapekto sa katapatan ng reaksyon at kalidad ng produkto. Ang tradisyunal na Taq polymerase ay pinalitan sa maraming mga laboratoryo ng mas mataas na fidelity enzymes (mga gumagawa ng mas kaunting mga error).

Ang konsentrasyon ng MgCl2 sa reaksyon ay maaaring maka-impluwensya sa kinalabasan ng PCR at maaaring maglagay ng isang mahalagang papel sa mas masayang reaksiyon. Magnesium cation ay bumubuo ng mga natutunaw na complex na may mga dNTP upang makabuo ng aktwal na substrate na kinikilala ng polymerase enzyme.

Ang pantay na halaga ng lahat ng apat na dNTPs ay tumutulong din na mabawasan ang rate ng error sa polymerase. Ang ilang mga additives tulad ng betaine, BSA, detergents, DMSO, gliserol, at pyrophosphatase ay maaari ring makaapekto sa enzyme pagtitiyak o kahusayan sa reaksyon.

05 Uri ng Thermocycler

Kapag namimili ng mga kagamitan sa laboratoryo, tandaan na ang ilang mga thermocycler ay mas tumpak kaysa sa iba sa pagpapanatili ng eksaktong, nais na mga temperatura.

Ito ay isang lugar na kung saan ang pagpunta cheap ay hindi magbabayad sa katagalan kapag ikaw ay nahaharap sa isang maselan reaksyon o paggamit primers na nangangailangan ng isang makitid na hanay ng temperatura pagsusubo.

Ang mga tubong reaksyon na may dingding na idinisenyo upang umangkop sa tumpak na tatak ng thermocycler na iyong ginagamit ay tumutulong din na ma-optimize ang mga temperatura ng reaksyon.

06 Mga Setting ng Ikot

Ang haba ng cycle ng reaksyon, mga temperatura, at isang bilang ng mga siklo, ang lahat ay may isang mahalagang papel sa pagtukoy kung gaano kahusay ang isang PCR ay gagana. Ang paunang pag-init na hakbang ay dapat sapat na mahaba upang lubusang mag-denature ang template at ang mga cycle ay dapat sapat na mahaba upang maiwasan ang natunaw na DNA mula sa reannealing sa sarili nito.

Ang nadagdag na ani ay maaaring makamit sa pamamagitan ng pagdaragdag ng oras ng extension tungkol sa bawat 20 na cycle, upang makabawi para sa mas kaunting enzyme upang palakasin ang higit pang template. Karaniwan, mas mababa sa 40 na cycle ay sapat na upang palakasin ang mas mababa sa 10 mga template molecule sa isang konsentrasyon na sapat na malaki upang tingnan sa isang ethidium bromide-stained agarose gel.