Mga Diskarte para sa Sequencing DNA

Ang larangan ng biotechnology ay isa sa patuloy na pagbabago. Ang mabilis na pag-unlad at pagpapaunlad ng pananaliksik sa pagputol ay nakasalalay sa makabagong ideya at pagkamalikhain ng mga siyentipiko at ang kanilang kakayahang makita ang potensyal sa isang pangunahing pamamaraan ng molecular at ilapat ito sa mga bagong proseso. Ang pagdating ng PCR ay nagbukas ng maraming pinto sa genetic research, kabilang ang isang paraan ng pag-aaral ng DNA at pagkakakilanlan ng iba't ibang mga gen base sa kanilang DNA sequence. Ang DNA sequencing ay nakasalalay din sa aming kakayahan na gumamit ng gel electrophoresis upang paghiwalayin ang mga hibla ng DNA na naiiba sa sukat ng kasing dali ng isang base pair.

DNA Sequencing

Sa huling bahagi ng dekada ng 1970, ang dalawang pamamaraan ng DNA sequencing para sa mas mahabang mga molecule ng DNA ay imbento: ang Sanger (o dideoxy) na pamamaraan at ang Maxam-Gilbert (kemikal cleavage) na pamamaraan. Ang pamamaraan ng Maxam-Gilbert ay batay sa partikular na cleavage ng nucleotide sa pamamagitan ng mga kemikal at pinakamainam na ginagamit sa pagkakasunud-sunod ng oligonucleotides (maikling mga polymers ng nucleotide, karaniwan ay mas maliit sa 50 base-pairs na haba). Ang paraan ng Sanger ay mas karaniwang ginagamit sapagkat ito ay napatunayan nang technically mas madaling mag-aplay, at, sa pagdating ng PCR at pag-automate ng pamamaraan, ay madaling inilapat sa mahahabang mga hibla ng DNA kabilang ang ilang buong genes.

Ang pamamaraan na ito ay batay sa pagwawakas ng chain sa pamamagitan ng dideoxynucleotides sa panahon ng mga reaksyon ng PCR elongation.

Sanger Method

Sa paraan ng Sanger, ginamit ang DNA strand na sinusuri bilang isang template at ang polymerase ng DNA ay ginagamit, sa isang reaksyon ng PCR, upang makabuo ng mga komplikadong mga hibla gamit ang mga primer. Ang apat na magkakaibang paghahalo ng reaksyon sa PCR ay inihanda, ang bawat isa ay naglalaman ng isang tiyak na porsyento ng mga analog na dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) sa isa sa apat na nucleotides (ATP, CTP, GTP o TTP).

Ang synthesis ng bagong DNA strand ay nagpapatuloy hanggang sa ang isa sa mga analog na ito ay inkorporada, kung saan ang oras ay ang unti-unting pinutol. Ang bawat reaksyon ng PCR ay magtatapos na naglalaman ng isang timpla ng iba't ibang mga haba ng mga hibla ng DNA, lahat ng nagtatapos sa nucleotide na dideoxy na may label na reaksyon. Ang gel electrophoresis ay pagkatapos ay ginagamit upang paghiwalayin ang mga hibla ng apat na mga reaksyon, sa apat na magkahiwalay na daanan, at matukoy ang pagkakasunud-sunod ng orihinal na template batay sa kung anong haba ng mga hangganan ang natapos sa kung ano ang nucleotide.

Sa automated Sanger reaksyon, ginagamit ang mga primero na may label na may apat na magkakaibang kulay na mga tag na fluorescent. Ang mga reaksyon ng PCR, sa pagkakaroon ng iba't ibang dideoxynucleotides, ay ginaganap gaya ng inilarawan sa itaas. Gayunpaman, sa susunod, ang apat na mga mixtures ng reaksyon ay pinagsama at inilapat sa isang solong lane ng isang gel. Ang kulay ng bawat fragment ay nakita gamit ang laser beam at ang impormasyon ay nakolekta ng isang computer na bumubuo ng mga chromatograms na nagpapakita ng mga peak para sa bawat kulay, kung saan maaaring matukoy ang pagkakasunud-sunod ng DNA ng template.

Kadalasan, ang pamamaraan ng awtomatikong pagkakasunod-sunod ay tumpak lamang para sa mga pagkakasunud-sunod hanggang sa maximum na 700-800 base-pares ang haba. Gayunpaman, posible na makuha ang buong mga pagkakasunud-sunod ng mga mas malaking gene at, sa katunayan, ang buong genome, gamit ang mga hakbang na pamamaraan tulad ng Primer Walking and Shotgun sequencing.

Sa panimulang paglalakad, isang maisasagawa na bahagi ng isang mas malaking gene ay sinundan gamit ang Sanger na pamamaraan. Ang mga bagong primer ay nabuo mula sa isang maaasahang segment ng pagkakasunud-sunod at ginagamit upang magpatuloy sa pagkakasunud-sunod ng bahagi ng gene na wala sa hanay ng mga orihinal na reaksyon.

Ang pagkakasunud-sunod ng pagbaril ay nangangailangan ng sapalarang pagputol ng segment ng DNA ng interes sa mas naaangkop na mga (naaayos na) sized na mga fragment, pagkakasunud-sunod ng bawat fragment, at pagsasaayos ng mga piraso batay sa magkakasabay na mga pagkakasunud-sunod. Ang pamamaraan na ito ay ginawang mas madali sa pamamagitan ng aplikasyon ng software ng computer para sa pag-aayos ng magkasanib na mga piraso.